Кисспептин-10 (Kisspeptin-10)

KISS1R, первоначально называвшийся GPR54. Он расположен на ГнРГ-нейронах головного мозга. У людей без работающей копии этого рецептора половое созревание никогда не начинается.

Оба происходят из одного предшественника. Кисспептин-54 является длинной формой; кисспептин-10 – это его последние десять аминокислот, часть, которая связывается с рецептором. Длинная форма дольше сохраняется в крови.

Кисспептин действует на один уровень выше, на нейроны, выделяющие ГнРГ. Гонадорелин – это сам ГнРГ, действующий на гипофиз.

Его C-концевой амид (-NH2 на конечном фенилаланине) является частью природного гормона и необходим для полной активности на рецепторе. Его сертификат подтверждает наличие амида.

Десять герметичных флаконов лиофилизированного кисспептина-10 из одной партии, по 5 мг или 10 мг во флаконе. Один отчет о партии охватывает все десять.

Кисспептин-10 доставляется в виде лиофилизированного порошка в герметичных флаконах, который остается стабильным при комнатной температуре во время транспортировки. Каждый заказ отправляется в простой упаковке с отслеживанием, и большинство прибывает в течение 7–14 дней. После получения храните его в морозильной камере при -20°C. Сертификат анализа для партии, которую мы отправляем сейчас, находится на нашей странице с результатами лабораторных исследований.

Наш кисспептин-10 (Kisspeptin-10) превышает >98% чистоты, подтвержденной обращенно-фазовой ВЭЖХ, демонстрирующей время удерживания, характерное для последовательности декапептида (обычно Tyr-Asn-Trp-Asn-Ser-Phe-Gly-Leu-Arg-Phe-NH2 для человеческого KP-10). Каждая партия проходит комплексный контроль качества: подтверждение молекулярной массы (~1302 Да) методом масс-спектрометрии, подтверждающее полную последовательность из десяти аминокислот, включая C-концевое амидирование (критически важное для биоактивности – неамидированный кисспептин показывает значительно сниженную активацию GPR54), секвенирование пептида методом деградации по Эдману или фрагментации МС/МС, подтверждающее каждый остаток и консервативный C-концевой мотив Arg-Phe-NH2, необходимый для связывания с рецептором, биоанализы связывания с рецептором GPR54 с использованием клеток, экспрессирующих GPR54 (CHO-GPR54, HEK293-GPR54), измеряющие конкурентное вытеснение меченого кисспептина или мобилизацию кальция IC50/EC50 (обычно 1–10 нМ, демонстрирующие высокоаффинное распознавание рецептора), функциональные биоанализы секреции ЛГ с обработкой первичных культур гонадотрофов гипофиза или интактной ткани гипофиза кисспептином-10 с измерением высвобождения ЛГ методом ИФА/РИА с определением EC50 дозозависимой кривой (наномолярный диапазон), анализы мобилизации кальция с использованием флуоресцентных индикаторов Ca²⁺ (Fluo-4, Fura-2) в клетках, экспрессирующих GPR54, демонстрирующие дозозависимое повышение внутриклеточного Ca²⁺ кисспептином-10, подтверждающее активацию пути Gq-PLC-IP3, анализы десенсибилизации рецептора, показывающие, что непрерывное воздействие кисспептина-10 снижает ответ по сравнению с пульсирующим введением (подтверждающие физиологическую потребность в пульсации), тестирование на эндотоксины (<0.1 EU/мг) и комплексный Сертификат анализа.

Помимо химической чистоты (ВЭЖХ >98%, масс-спектрометрия, подтверждающая последовательность декапептида и C-концевое амидирование), мы применяем комплексную проверку рецептора GPR54 и функциональную валидацию: (1) Проверка C-концевого амидирования: масс-спектрометрия с точным измерением молекулярной массы (~1302 Да для амидированной формы против ~1303 Да для свободной кислоты), подтверждающая наличие -NH2, необходимое для биоактивности. (2) Анализы связывания GPR54: с использованием клеток, стабильно экспрессирующих человеческий GPR54 (CHO-GPR54, HEK293-GPR54), измеряющих конкурентное вытеснение меченого кисспептина ([125I]-кисспептин) или флуоресцентного лиганда с определением IC50 (обычно 1-10 нМ), подтверждающего высокоаффинное распознавание рецептора. (3) Анализы мобилизации кальция: обработка клеток, экспрессирующих GPR54, возрастающими дозами Kisspeptin-10 с измерением в реальном времени внутриклеточного повышения Ca²⁺ с помощью флуоресценции Fluo-4 или Fura-2, количественно определяющая EC50 (в наномолярном диапазоне), демонстрирующая активацию пути Gq-белок-опосредованного PLC-IP3-Ca²⁺, который связан с секрецией ГнРГ. (4) Биоанализы секреции ЛГ: критическая функциональная валидация: обработка первичных культур гонадотрофов гипофиза или эксплантов ткани гипофиза Kisspeptin-10 с измерением высвобождения ЛГ в среду с помощью ELISA или RIA, демонстрирующая дозозависимую секрецию ЛГ с количественной оценкой EC50, подтверждающая перенос активации GPR54 в гормональный ответ. (5) Фосфорилирование ERK1/2: вестерн-блот, показывающий, что Kisspeptin-10 активирует путь MAPK в клетках, экспрессирующих GPR54. (6) Кинетика десенсибилизации рецептора: демонстрация того, что непрерывное воздействие Kisspeptin-10 снижает кальциевые ответы по сравнению с пульсирующим введением, подтверждающая физиологическую потребность в пульсирующей стимуляции. (7) Контроль селективности: показ того, что Kisspeptin-10 активирует клетки, экспрессирующие GPR54, но не родительские клетки без рецептора, подтверждающий рецептор-опосредованные эффекты. (8) Сравнение с неамидированной формой: если доступно, демонстрация того, что амидированный Kisspeptin-10-NH2 обладает в 100-1000 раз большей активностью, чем Kisspeptin-10-OH, подтверждающая важность амидирования.