Kisspeptin-10

KISS1R, inizialmente chiamato GPR54. Si trova sui neuroni GnRH del cervello. Le persone prive di una copia funzionante non iniziano mai la pubertà.

Entrambi derivano dallo stesso precursore. Kisspeptin-54 è la forma lunga; kisspeptin-10 è la sua parte finale di dieci amminoacidi, quella che si lega al recettore. La forma lunga dura più a lungo nel sangue.

La kisspeptina agisce un gradino più in alto, sui neuroni che rilasciano GnRH. La gonadorelina è il GnRH stesso, che agisce sull'ipofisi.

La sua ammide C-terminale (il -NH2 sulla fenilalanina finale) fa parte dell'ormone naturale ed è necessaria per la piena attività sul recettore. Il suo certificato mostra l'ammide.

Dieci fiale sigillate di kisspeptin-10 liofilizzata, tutte dello stesso lotto, da 5 mg o 10 mg per fiala. Un unico rapporto di lotto copre tutte e dieci.

Kisspeptin-10 viene spedita come polvere liofilizzata in fiale sigillate, che rimane stabile a temperatura ambiente per il trasporto. Ogni ordine viene inviato in imballaggio anonimo con tracciabilità e la maggior parte arriva in 7-14 giorni. Conservarla in congelatore a -20°C una volta arrivata. Il Certificato di Analisi per il lotto che stiamo spedendo ora è sulla nostra pagina dei risultati di laboratorio.

Il nostro Kisspeptin-10 supera >98% di purezza verificata mediante HPLC in fase inversa che dimostra un tempo di ritenzione caratteristico della sequenza decapeptidica (tipicamente Tyr-Asn-Trp-Asn-Ser-Phe-Gly-Leu-Arg-Phe-NH2 per KP-10 umano). Ogni lotto è sottoposto a un controllo qualità completo: spettrometria di massa per la conferma del peso molecolare (~1302 Da) che convalida la sequenza completa di dieci amminoacidi inclusa l'amidazione C-terminale (critica per la bioattività: la kisspeptina non amidata mostra un'attivazione di GPR54 marcatamente ridotta), sequenziamento peptidico mediante degradazione di Edman o frammentazione MS/MS che verifica ogni residuo e conferma il motivo conservato Arg-Phe-NH2 C-terminale essenziale per il legame recettoriale, saggi di legame al recettore GPR54 utilizzando cellule che esprimono GPR54 (CHO-GPR54, HEK293-GPR54) che misurano lo spostamento competitivo di kisspeptina radiomarcata da parte di Kisspeptin-10 o la mobilizzazione del calcio IC50/EC50 (tipicamente 1-10 nM a dimostrazione del riconoscimento recettoriale ad alta affinità), saggi funzionali di secrezione di LH trattando colture primarie di gonadotrofi ipofisari o tessuto ipofisario integro con Kisspeptin-10 e misurando il rilascio di LH mediante ELISA/RIA quantificando la EC50 dose-risposta (range nanomolare), saggi di mobilizzazione del calcio utilizzando indicatori fluorescenti di Ca²⁺ (Fluo-4, Fura-2) in cellule che esprimono GPR54 che dimostrano che Kisspeptin-10 aumenta in modo dose-dipendente il Ca²⁺ intracellulare convalidando l'attivazione della via Gq-PLC-IP3, saggi di desensibilizzazione recettoriale che mostrano come l'esposizione continua a Kisspeptin-10 riduca la risposta rispetto alla somministrazione pulsatile (convalidando il requisito fisiologico del polso), test delle endotossine (<0.1 EU/mg) e Certificato di Analisi completo.

Oltre alla purezza chimica (HPLC >98%, spettrometria di massa che conferma la sequenza del decapeptide e l'amidazione C-terminale), impieghiamo una validazione completa del recettore GPR54 e funzionale: (1) Verifica dell'amidazione C-terminale: spettrometria di massa che misura con precisione il peso molecolare (~1302 Da per la forma amidata vs ~1303 Da per l'acido libero) confermando la presenza di -NH2 essenziale per la bioattività. (2) Saggi di binding al recettore GPR54: utilizzo di cellule che esprimono stabilmente il recettore umano GPR54 (CHO-GPR54, HEK293-GPR54) misurando lo spiazzamento competitivo del kisspeptin radiomarcato ([125I]-kisspeptin) o del ligando fluorescente da parte del Kisspeptin-10, determinando l'IC50 (tipicamente 1-10 nM) e confermando il riconoscimento recettoriale ad alta affinità. (3) Saggi di mobilizzazione del calcio: trattamento di cellule che esprimono GPR54 con dosi crescenti di Kisspeptin-10 misurando l'aumento in tempo reale del Ca²⁺ intracellulare tramite fluorescenza Fluo-4 o Fura-2, quantificando l'EC50 (range nanomolare) e dimostrando l'attivazione della via Gq-proteina-PLC-IP3-Ca²⁺ che si accoppia alla secrezione di GnRH. (4) Saggi di secrezione di LH: validazione funzionale critica: trattamento di colture primarie di gonadotropi ipofisari o espianti di tessuto ipofisario con Kisspeptin-10 misurando il rilascio di LH nel mezzo tramite ELISA o RIA, dimostrando una secrezione di LH dose-dipendente con quantificazione dell'EC50, validando la traduzione dell'attivazione di GPR54 in output ormonale. (5) Fosforilazione di ERK1/2: Western blot che mostra che il Kisspeptin-10 attiva la via MAPK in cellule che esprimono GPR54. (6) Cinetica di desensibilizzazione del recettore: dimostrazione che l'esposizione continua al Kisspeptin-10 riduce le risposte del calcio rispetto alla somministrazione pulsatile, validando il requisito fisiologico della stimolazione pulsatile. (7) Controlli di selettività: dimostrazione che il Kisspeptin-10 attiva cellule che esprimono GPR54 ma non cellule parentali prive del recettore, confermando effetti mediati dal recettore. (8) Confronto con la forma non amidata: se disponibile, dimostrazione che il Kisspeptin-10-NH2 amidato ha una potenza da 100 a 1000 volte maggiore rispetto al Kisspeptin-10-OH, validando l'importanza dell'amidazione.