Кіспептин-10 (Kisspeptin-10)

KISS1R, спочатку названий GPR54. Він розташований на GnRH-нейронах мозку. У людей без функціональної копії цього рецептора статеве дозрівання ніколи не починається.

Обидва походять з одного попередника. Кіспептин-54 є довгою формою; кіспептин-10 – це його останні десять амінокислот, частина, яка зв'язується з рецептором. Довга форма довше залишається в крові.

Кіспептин діє на один рівень вище, на нейрони, які вивільняють GnRH. Гонадорелін – це сам GnRH, який діє на гіпофіз.

Його C-кінцевий амід (-NH2 на кінцевому фенілаланіні) є частиною природного гормону і необхідний для повної активності на рецепторі. Сертифікат підтверджує наявність аміду.

Десять герметичних флаконів ліофілізованого кіспептину-10 з однієї партії, по 5 мг або 10 мг у флаконі. Один звіт про партію охоплює всі десять флаконів.

Кіспептин-10 доставляється у вигляді ліофілізованого порошку в герметичних флаконах, який залишається стабільним за кімнатної температури під час транспортування. Кожне замовлення відправляється в простій упаковці з відстеженням, і більшість прибуває протягом 7–14 днів. Після отримання зберігайте в морозильній камері при -20°C. Сертифікат аналізу для партії, яку ми відправляємо зараз, доступний на нашій сторінці лабораторних результатів.

Наш кіспептин-10 перевищує >98% чистоти, підтвердженої зворотно-фазовою ВЕРХ, що демонструє час утримування, характерний для декапептидної послідовності (зазвичай Tyr-Asn-Trp-Asn-Ser-Phe-Gly-Leu-Arg-Phe-NH2 для людського KP-10). Кожна партія проходить комплексний контроль якості: підтвердження молекулярної маси мас-спектрометрією (~1302 Да), що підтверджує повну послідовність із десяти амінокислот, включаючи C-кінцеве амідування (критичне для біоактивності – неамідований кіспептин демонструє значно знижену активацію GPR54); секвенування пептиду методом Едмана або фрагментацією МС/МС, що підтверджує кожен залишок і консервативний C-кінцевий мотив Arg-Phe-NH2, необхідний для зв'язування з рецептором; біоаналізи зв'язування з рецептором GPR54 з використанням клітин, що експресують GPR54 (CHO-GPR54, HEK293-GPR54), що вимірюють конкурентне витіснення радіоактивно міченого кіспептину або мобілізацію кальцію IC50/EC50 (зазвичай 1–10 нМ, що демонструє високоафінне розпізнавання рецептора); функціональні біоаналізи секреції ЛГ з обробкою первинних культур гонадотрофів гіпофіза або інтактної тканини гіпофіза кіспептином-10, що вимірюють вивільнення ЛГ за допомогою ІФА/РІА з кількісним визначенням дозозалежної EC50 (наномолярний діапазон); аналізи мобілізації кальцію з використанням флуоресцентних індикаторів Ca²⁺ (Fluo-4, Fura-2) у клітинах, що експресують GPR54, що демонструють дозозалежне підвищення внутрішньоклітинного Ca²⁺, підтверджуючи активацію шляху Gq-PLC-IP3; аналізи десенсибілізації рецептора, що показують зниження відповіді при безперервному впливі кіспептину-10 порівняно з пульсуючим введенням (підтверджуючи фізіологічну потребу в пульсації); тестування на ендотоксини (<0.1 ОЕ/мг) та комплексний сертифікат аналізу.

Окрім хімічної чистоти (HPLC >98%, мас-спектрометрія, що підтверджує послідовність декапептиду та С-кінцеве амідування), ми застосовуємо комплексну валідацію рецептора GPR54 та функціональну валідацію: (1) Перевірка С-кінцевого амідування - мас-спектрометрія, що точно вимірює молекулярну масу (~1302 Да для амідованої форми проти ~1303 Да для вільної кислоти), підтверджує наявність -NH2, необхідного для біоактивності. (2) Аналізи зв'язування GPR54 - з використанням клітин, що стабільно експресують людський GPR54 (CHO-GPR54, HEK293-GPR54), вимірюючи конкурентне витіснення Kisspeptin-10 радіоактивно міченого кіспептину ([125I]-кіспептин) або флуоресцентного ліганду, визначаючи IC50 (зазвичай 1-10 нМ), що підтверджує високоафінне впізнавання рецептора. (3) Аналізи мобілізації кальцію - обробка клітин, що експресують GPR54, зростаючими дозами Kisspeptin-10 з вимірюванням у реальному часі внутрішньоклітинного підвищення Ca²⁺ за допомогою флуоресценції Fluo-4 або Fura-2, кількісне визначення EC50 (нанмолярний діапазон), що демонструє активацію шляху Gq-опосередкованого PLC-IP3-Ca²⁺, який пов'язаний із секрецією ГнРГ. (4) Біоаналізи секреції ЛГ - критична функціональна валідація: обробка первинних культур гонадотрофів гіпофіза або експлантів тканини гіпофіза Kisspeptin-10 з вимірюванням вивільнення ЛГ у середовище за допомогою ІФА або РІА, що демонструє дозозалежну секрецію ЛГ з кількісним визначенням EC50, підтверджуючи перехід від активації GPR54 до гормонального виходу. (5) Фосфорилювання ERK1/2 - вестерн-блот, що показує активацію шляху MAPK у клітинах, що експресують GPR54, під впливом Kisspeptin-10. (6) Кінетика десенсибілізації рецептора - демонстрація того, що безперервна експозиція Kisspeptin-10 знижує кальцієві відповіді порівняно з пульсуючим введенням, підтверджуючи фізіологічну потребу в пульсуючій стимуляції. (7) Контроль селективності - показ того, що Kisspeptin-10 активує клітини, що експресують GPR54, але не батьківські клітини без рецептора, підтверджуючи ефекти, опосередковані рецептором. (8) Порівняння з неамідованою формою - якщо доступно, демонстрація того, що амідований Kisspeptin-10-NH2 має у 100-1000 разів більшу активність, ніж Kisspeptin-10-OH, підтверджуючи важливість амідування.