Os métodos analíticos por trás de cada certificado

Separa o peptídeo alvo das impurezas do processo por hidrofobicidade e relata a pureza como uma porcentagem da área total do pico em um comprimento de onda de detecção fixo.

Confirma a identidade medindo a massa molecular do material eluído e comparando-a com a massa teórica da sequência.

Teor de água do sólido liofilizado, por titulação em vez de perda por secagem.

Carga de endotoxina, em unidades de endotoxina por miligrama, por ensaio de lisado de amebócitos do limulus, geralmente a variante cromogênica cinética.

Separa por peso molecular aparente em um gel e é usada para as proteínas maiores do catálogo, onde uma coluna de fase reversa desnaturaria a molécula.

Agregados e espécies de alto peso molecular, relatados como teor de monômero. Para uma proteína dobrada, este, e não a área em fase reversa, é o valor de pureza significativo.

Teor de metais traço, incluindo metais pesados e, quando um peptídeo é fornecido como um complexo metálico, o próprio metal pretendido.

Teor de contra-íon, tipicamente acetato ou trifluoroacetato remanescente da purificação.

Solvente orgânico volátil transportado da síntese e purificação, por cromatografia gasosa headspace.

Concentração de peptídeo ou proteína, teor de tióis livres, nitrogênio total e pH. Estas são as determinações que convertem uma porcentagem de área em uma quantidade real de material.

Atividade biológica em um sistema celular ou de ligação, usada quando o valor de uma molécula depende dela fazer algo, em vez de meramente estar presente e pura.

Aparência do bolo liofilizado e da solução reconstituída, e contagem de partículas subvisíveis quando aplicável.

Quais métodos analíticos são usados para testar peptídeos de pesquisa?

HPLC em fase reversa para pureza, espectrometria de massas para identidade e titulação de Karl Fischer para teor de água são os três principais para um peptídeo sintético. Endotoxina bacteriana por LAL, aspecto, pH e substâncias relacionadas são rotineiramente adicionados. Proteínas maiores passam para SDS-PAGE e HPLC de exclusão por tamanho, porque condições de fase reversa as desnaturam, e complexos metálicos adicionam análise elementar por ICP.

Um alto resultado de pureza por HPLC significa que o frasco contém essa quantidade de peptídeo?

Não, e este é o número mais mal interpretado no campo. A pureza por HPLC é uma porcentagem de área: o pico alvo como proporção de tudo o que o detector viu. Água, sal e contra-íon não absorvem no comprimento de onda de detecção, portanto não estão nesse cálculo. Um frasco pode ser 99% puro por HPLC e ainda assim ser uma fração significativa de água e acetato em massa, por isso o teor de água e o teor de contra-íon são determinações separadas no mesmo certificado.

O laboratório de testes é acreditado ISO 17025?

A análise confirmatória é realizada em laboratório com acreditação ISO/IEC 17025, o padrão internacional para a competência de laboratórios de ensaio. Vale a pena saber como esse padrão funciona: ele é concedido a laboratórios, não a fornecedores, portanto, um vendedor que afirma ser acreditado 17025 por si só está descrevendo algo que não existe, a menos que opere um laboratório acreditado próprio. O que importa é a acreditação do laboratório que realiza o trabalho, seu escopo e se o número do certificado pode ser verificado junto ao órgão emissor. Todos os três estão publicados na página de qualidade e testes.

O que significa uma coluna de especificação em um Certificado de Análise?

É o limite acordado antes de a amostra ser analisada. Um resultado só é significativo em relação a uma especificação, porque é a especificação que torna o resultado uma aprovação ou reprovação, em vez de apenas um número. Um certificado que relata resultados sem coluna de especificação não testou nada, apenas mediu.

Por que os painéis de teste diferem entre compostos?

Porque o método precisa se adequar à molécula. Aplicar um gradiente de fase reversa a uma proteína dobrada a desnatura, então seu valor de pureza seria sem sentido; o conteúdo de monômero por exclusão de tamanho é a medida correta. Um peptídeo ligado a cobre precisa de análise elementar que um peptídeo comum não precisa. Um painel idêntico em todos os produtos de um catálogo é um sinal de que o painel foi projetado para aparência, não para a química.